细胞裂解液样本制备

细胞裂解液样本处理protocol

说明：本实验与免疫共沉淀实验中处理细胞目的一样，即是细胞膜破裂，胞浆蛋白释放出来，保证蛋白质不变性。该处理方法无法得到膜蛋白，如果需要提取膜蛋白，须专用的膜蛋白提取试剂盒。

推荐使用：NP-40细胞裂解缓冲液/IP裂解液

组分：50 mM Tris（pH 值 7.4）、250 mM NaCl、5 mM EDTA、50 mM NaF、1 mM Na3VO4、1% 去污剂、0.02% NaN3。

适用范围：细胞裂解缓冲液 II 是一种高质量、即用型裂解缓冲液，适用于制备用于 ELISA、Western 印迹和抗体微珠免疫检测 (Luminex) 应用的细胞提取物。该缓冲液用于总蛋白提取，并利用基于去污剂的裂解方式，无需机械性细胞破碎。该制剂有助于保留酶检测或免疫检测所需的蛋白结构和功能。

同时加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，防止蛋白酶解

步骤：

a）贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，用胰酶消化，加适量培育基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可直接离心收集。

b）收集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培育基，用预冷的PBS清洗3次。

c）以2x10⁶细胞为例，在样本中加入1mL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理。

打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。

d）4℃12000×g 离心10min，除掉细胞碎片。

e) 取上清，BCA总蛋白定量。或者分装多份，-20℃或-80℃保存，防止反复冻融。